Obiettivi. Il monitoraggio ambientale basato sulla ricerca di indicatori rappresenta un importante strumento per la valutazione del rischio biologico nelle matrici idriche. Tuttavia per la scarsa correlabilità tra questi ed alcuni patogeni, soprattutto di natura virale, è stata suggerita anche a livello internazionale (OMS, EPA), la ricerca di 'patogeni indice' soprattutto per alcune matrici come ad esempio le acque di sorgente, quelle reflue trattate riemesse nell'ambiente e quelle destinate ad un riutilizzo agricolo o industriale. Uno dei problemi più rilevanti per tale scopo è la possibilità di avere un elevato numero di microrganismi patogeni e la difficoltà di eseguire dei test che permettano di identificarli simultaneamente. Questo approccio è ora possibile grazie ai progressi nel campo della biologia molecolare, che permettono un'analisi microbiologica più sofisticata riuscendo a risolvere molti problemi associati anche alla non colturabilità. In particolare, la "nanotecnologia" del DNA microarray, potrebbe essere applicata per valutare il rischio biologico nei campioni di acqua. L'elevato numero di sequenze sonde di DNA che possono essere inserite unitamente alla specificità di legame tra i target e queste, permettono il rilevamento simultaneo di una vasta gamma di generi, specie e ceppi microbici con elevata capacità discriminatoria. Tuttavia l'applicazione di questa tecnologia in campo ambientale richiede uno studio approfondito della sua sensibilità e specificità, nonché il confronto con le tecniche tradizionali. In questo lavoro, è stato sviluppato un oligonucleotide microarray per lo screening di microrganismi enterici (virus e batteri) legati all'inquinamento idrico: adenovirus, norovirus GGII, virus dell'epatite A, enterovirus, rotavirus, E.coli O157H7 e Salmonella enterica . Metodi. Dopo una prima fase, dove sono state identificate per ciascun microrganismo le regioni genomiche più conservate per la sintesi del microarray, sono stati allestiti una serie di test per verificare la specificità con campioni ad alto titolo per ciascun target. Quindi la metodica è stata testata con campioni di acqua reflua contaminata artificialmente per verificare la sensibilità con matrici simili a quelli "naturali". Dopo concentrazione, gli acidi nucleici sono stati contemporaneamente quantificati, mediante real time PCR, per stimare la contaminazione (copie genomiche/μl) e analizzati con la piattaforma microarray. Conoscendo la concentrazione iniziale di ciascun microrganismo ed il volume dei campioni depositato è stato possibile avere una stima della sensibilità. Risultati. I risultati dei test su campioni ad alto titolo hanno confermato la specificità della piattaforma microarray: ciascun microrganismo bersaglio è stato identificato. Il test sui campioni artificialmente contaminati hanno rivelato un limite di sensibilità media per ciascun target microbico di 1000-10000 copie genomiche/μl, corrispondente a 10^9-10^10 copie genomiche/L. Conclusioni. I dati ottenuti sono stati molto promettenti per l'applicazione della tecnica su matrici idriche dove la problematica correlazione indicatori-patogeni è ben nota e dove la concentrazione dei patogeni che si raggiunge è costantemente conforme al livello di sensibilità ottenuta, come nei reflui. Tuttavia per poterne auspicarne una sua applicazione in altre matrici come acque superficiali o potabili dove la contaminazione è molto più bassa, risulta necessario effettuare ulteriori studi per implementarne la sensibilità soprattutto nella fase di concentrazione e purificazione del campione dalla presenza di inibitori.

Ricerca di microrganismi patogeni enterici in matrici idriche mediante l'utilizzo della tecnologia del microarray

VERANI, MARCO;CARDUCCI, ANNALAURA
2013

Abstract

Obiettivi. Il monitoraggio ambientale basato sulla ricerca di indicatori rappresenta un importante strumento per la valutazione del rischio biologico nelle matrici idriche. Tuttavia per la scarsa correlabilità tra questi ed alcuni patogeni, soprattutto di natura virale, è stata suggerita anche a livello internazionale (OMS, EPA), la ricerca di 'patogeni indice' soprattutto per alcune matrici come ad esempio le acque di sorgente, quelle reflue trattate riemesse nell'ambiente e quelle destinate ad un riutilizzo agricolo o industriale. Uno dei problemi più rilevanti per tale scopo è la possibilità di avere un elevato numero di microrganismi patogeni e la difficoltà di eseguire dei test che permettano di identificarli simultaneamente. Questo approccio è ora possibile grazie ai progressi nel campo della biologia molecolare, che permettono un'analisi microbiologica più sofisticata riuscendo a risolvere molti problemi associati anche alla non colturabilità. In particolare, la "nanotecnologia" del DNA microarray, potrebbe essere applicata per valutare il rischio biologico nei campioni di acqua. L'elevato numero di sequenze sonde di DNA che possono essere inserite unitamente alla specificità di legame tra i target e queste, permettono il rilevamento simultaneo di una vasta gamma di generi, specie e ceppi microbici con elevata capacità discriminatoria. Tuttavia l'applicazione di questa tecnologia in campo ambientale richiede uno studio approfondito della sua sensibilità e specificità, nonché il confronto con le tecniche tradizionali. In questo lavoro, è stato sviluppato un oligonucleotide microarray per lo screening di microrganismi enterici (virus e batteri) legati all'inquinamento idrico: adenovirus, norovirus GGII, virus dell'epatite A, enterovirus, rotavirus, E.coli O157H7 e Salmonella enterica . Metodi. Dopo una prima fase, dove sono state identificate per ciascun microrganismo le regioni genomiche più conservate per la sintesi del microarray, sono stati allestiti una serie di test per verificare la specificità con campioni ad alto titolo per ciascun target. Quindi la metodica è stata testata con campioni di acqua reflua contaminata artificialmente per verificare la sensibilità con matrici simili a quelli "naturali". Dopo concentrazione, gli acidi nucleici sono stati contemporaneamente quantificati, mediante real time PCR, per stimare la contaminazione (copie genomiche/μl) e analizzati con la piattaforma microarray. Conoscendo la concentrazione iniziale di ciascun microrganismo ed il volume dei campioni depositato è stato possibile avere una stima della sensibilità. Risultati. I risultati dei test su campioni ad alto titolo hanno confermato la specificità della piattaforma microarray: ciascun microrganismo bersaglio è stato identificato. Il test sui campioni artificialmente contaminati hanno rivelato un limite di sensibilità media per ciascun target microbico di 1000-10000 copie genomiche/μl, corrispondente a 10^9-10^10 copie genomiche/L. Conclusioni. I dati ottenuti sono stati molto promettenti per l'applicazione della tecnica su matrici idriche dove la problematica correlazione indicatori-patogeni è ben nota e dove la concentrazione dei patogeni che si raggiunge è costantemente conforme al livello di sensibilità ottenuta, come nei reflui. Tuttavia per poterne auspicarne una sua applicazione in altre matrici come acque superficiali o potabili dove la contaminazione è molto più bassa, risulta necessario effettuare ulteriori studi per implementarne la sensibilità soprattutto nella fase di concentrazione e purificazione del campione dalla presenza di inibitori.
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