Il genoma di Mycobacterium tuberculosis codifica per 68 proteine ricche in glicina e asparagina caratterizzate da un dominio conservato N-terminale di circa 180 aminoacidi, comprendente il motivo aminoacidico prolina-prolina-acido glutamico (PPE) e da un segmento variabile C-terminale. Le proteine PPE sono antigenicamente polimorfiche e si ritiene che abbiano un significato immunologico nell'infezione tubercolare, probabilmente come fonte di variabilità antigenica e/o inibendo la processazione dell'antigene. Sulla base di precedenti studi in cui avevamo dimostrato che il gene Rv2770c di M. tuberculosis H37Rv, codificante per la proteina PPE44, è sottoespresso nel ceppo attenuato H37Ra, è stata intrapresa una ricerca volta a definire il ruolo della proteina PPE44 nell’infezione tubercolare. A tale scopo, il gene Rv2770c di M. tuberculosis H37Rv, ottenuto mediante PCR con primers specifici fiancheggianti la regione codificante, è stato clonato in E. coli XL1Blue nel plasmide pQE-30 UA. Dopo sequenziamento nucleotidico per verificare il corretto orientamento dell'inserto, il DNA plasmidico ottenuto è stato impiegato per trasformare E. coli M15(pREP4); l'espressione della proteina PPPE44 ricombinante (rPPE44) è stata indotta mediante IPTG e verificata mediante analisi SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpo anti-(His)5; la proteina rPPE44 è stata infine purificata per affinità con agarosio-acido nitrilotriacetico Ni2+. Studi preliminari hanno dimostrato che la proteina rPPE44 induce proliferazione cellulare e produzione di interferon- (IFN-) in colture di linfociti di sangue periferico di individui tubercolino-positivi, analogamente al derivato proteico purificato della tubercolina (PPD). L’infezione sperimentale per via sottocutanea di topi BALB/c con Mycobacterium bovis BCG induce anticorpi IgG anti-rPPE44 e una debole risposta immune T-dipendente anti-rPPE44, rispetto a quella anti-PPD, valutata in vitro come produzione di IFN-in colture di splenociti e di cellule di linfonodi drenanti ed in vivo come incremento di spessore del cuscinetto plantare dopo challenge specifico intracutaneo. Nel complesso, i dati immunologici preliminari indicano che la proteina PPE44 costituisce un nuovo antigene di M. tuberculosis espresso nel corso dell’infezione tubercolare, il cui ruolo merita di essere approfondito.
Clonaggio molecolare e caratterizzazione immunologica preliminare della proteina PPE44 di Mycobacterium tuberculosis
RINDI, LAURA;GARZELLI, CARLO;
2003-01-01
Abstract
Il genoma di Mycobacterium tuberculosis codifica per 68 proteine ricche in glicina e asparagina caratterizzate da un dominio conservato N-terminale di circa 180 aminoacidi, comprendente il motivo aminoacidico prolina-prolina-acido glutamico (PPE) e da un segmento variabile C-terminale. Le proteine PPE sono antigenicamente polimorfiche e si ritiene che abbiano un significato immunologico nell'infezione tubercolare, probabilmente come fonte di variabilità antigenica e/o inibendo la processazione dell'antigene. Sulla base di precedenti studi in cui avevamo dimostrato che il gene Rv2770c di M. tuberculosis H37Rv, codificante per la proteina PPE44, è sottoespresso nel ceppo attenuato H37Ra, è stata intrapresa una ricerca volta a definire il ruolo della proteina PPE44 nell’infezione tubercolare. A tale scopo, il gene Rv2770c di M. tuberculosis H37Rv, ottenuto mediante PCR con primers specifici fiancheggianti la regione codificante, è stato clonato in E. coli XL1Blue nel plasmide pQE-30 UA. Dopo sequenziamento nucleotidico per verificare il corretto orientamento dell'inserto, il DNA plasmidico ottenuto è stato impiegato per trasformare E. coli M15(pREP4); l'espressione della proteina PPPE44 ricombinante (rPPE44) è stata indotta mediante IPTG e verificata mediante analisi SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpo anti-(His)5; la proteina rPPE44 è stata infine purificata per affinità con agarosio-acido nitrilotriacetico Ni2+. Studi preliminari hanno dimostrato che la proteina rPPE44 induce proliferazione cellulare e produzione di interferon- (IFN-) in colture di linfociti di sangue periferico di individui tubercolino-positivi, analogamente al derivato proteico purificato della tubercolina (PPD). L’infezione sperimentale per via sottocutanea di topi BALB/c con Mycobacterium bovis BCG induce anticorpi IgG anti-rPPE44 e una debole risposta immune T-dipendente anti-rPPE44, rispetto a quella anti-PPD, valutata in vitro come produzione di IFN-in colture di splenociti e di cellule di linfonodi drenanti ed in vivo come incremento di spessore del cuscinetto plantare dopo challenge specifico intracutaneo. Nel complesso, i dati immunologici preliminari indicano che la proteina PPE44 costituisce un nuovo antigene di M. tuberculosis espresso nel corso dell’infezione tubercolare, il cui ruolo merita di essere approfondito.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
